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菌株如何传代

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试验用菌种的培养传代方法  

 程序:    

冻干菌复苏———— 接种(斜面)            (菌种传代) 

(营养肉汤)       制备菌悬液         对照菌液   

 检定用标准菌种,由中国药品生物检定所提供,为冷冻干燥菌种。 

 菌种的复苏与保存在专用无菌室或超净工作台内进行。   

1  菌种的复苏   

 •把冻干菌种管、灭菌1ml 滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支,移入接种室或净化工作台。  

•先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕,再将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干,用75% 乙醇棉擦净,放在灭菌双碟内,待干。点燃酒精灯,将菌种管的封口一端在火焰上,烧灼红热,用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基,滴在灼热的菌种管封口一端,使骤冷而炸裂。  

• 取灭菌镊子,在火焰旁,将炸裂的管口打开,放入灭菌双碟内,另取1支灭菌滴管,在火焰旁吸取营养肉汤少许,加至菌种管底部,将冻干菌搅动促使溶解,随即吸出管内菌液,分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内,并将滴管及菌种管投入消毒液内,将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置35~37℃培养22~24 h。        

• 取出培养物,仔细观察菌苔形态、有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检,呈典型菌落后,转种3 代即可应用。如发现菌型不典型,可进行平板分离单菌落。   

2  菌种的传代与保存 

方法(1): 菌斜面    菌斜面(保存)    

• 培养基应新鲜制备,如斜面已无冷凝水者,不宜再使用。标签上著名菌名及接种日期。至冰箱取出的菌种斜面,应在室温放置约30分钟,待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。   

• 点燃酒精灯,用左手握住菌种斜面,将管口靠进火焰旁,右手拿接种棒后端,将接种环烧红30秒,随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼,往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼,右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞,拨开棉塞,将接种环伸人管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下,稍冷却再移至菌苔上,刮去少量菌苔,随即取出接种棒,并将菌种管口移至火焰旁。  

• 堵上棉塞,左手将菌种管放下,取营养琼脂斜面1支,照上述操作打开棉塞,将接种环伸入管内至琼脂斜面的低部,由底向上,将接种环轻贴斜面的表面曲折移动,使细菌划在斜面的表面上。 

• 取出接种棒,在火焰旁将培养基管棉塞堵上,然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。 

• 将已接种毕的细菌管置35~37℃培养22~24小时,霉菌管一般置20~25℃霉菌培养箱内培养7日。取出后放人冰箱保存,一般 3个月转种一次。  

方法2:菌斜面     营养肉汤    分离平板     菌斜面   

如果菌落形态不典型可纯化,按下列方法传代(分离菌落) : 

用接种环取上述菌管(斜面)菌苔少许接种置营养肉汤中(5ml/支,已灭菌), 置35~37℃培养18~24小时后,再用接种环取培养好的营养肉汤菌悬液(浓菌液),接种于分离平板,置35~37℃培养18~24小时,用接种针选典型菌落划线于营养琼脂斜面,置35~37℃培养18~24小时。一般同时接种几支管,其中一支用于以后菌种传代或接种到半固体琼脂培养基中,其它用做工作菌种。 

常用分离平板:  

大肠埃希菌——EMB琼脂平板  

铜绿假单胞菌——溴化十六烷三甲铵琼脂培养基 

金黄色葡萄球菌——甘露醇氯化钠琼脂培养基 

沙门菌——SS琼脂平板 

3 菌悬液的制备  

取上述培养好的菌种斜面移入接种室或净化工作台,放置室温后, 用接种环取菌苔少许接种置营养肉汤中(5ml/支,已灭菌), 将已接种毕的细菌管置35~37℃培养18~24小时,取出备用。一般于冰箱中保存可用7天。  

4 对照用菌液制备  

 取上述培养好的营养肉汤菌悬液(浓菌液)1ml,加到9ml  0.9%无菌氯化钠溶液混匀,为10-1, 再取另一只吸管吸取10-1菌液1 ml加到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液混匀,为10-2 ……以此类推,稀释至含活菌数在 50 ~ 100 个。用平板计数。  

 此稀释菌液用于试验后加阳性对照,可在1天内使用。 

菌种  菌种 工作菌种培养基 菌悬液 对照菌液 

大肠杆菌 营养琼脂斜面 营养肉汤 0.9%氯化钠溶液 

沙门菌 营养琼脂斜面 营养肉汤 0.9%氯化钠溶液 

金黄色葡萄球菌 营养琼脂斜面 营养肉汤 0.9%氯化钠溶液 

铜绿假单胞菌 营养琼脂斜面 营养肉汤  0.9%氯化钠溶液 

生孢梭菌 硫乙醇酸盐培养基  硫乙醇酸盐培养基  0.9%氯化钠溶液 

白色念珠菌  真菌琼脂斜面(改良) 真菌培养基  0.9%氯化钠溶液  

五、菌种保管  

•菌种保管应有专人负责,保存与加锁的冰箱中或特制的白铁箱中加锁置阴暗处,确保菌种安全。因工作变动时,必须做好交接工作。    

•菌种应有详细登记本,包括名称、分离日期、鉴定日期、鉴定者、主要鉴定性能,并注意记录使用、转移及销毁情况和原因。    

•各种菌种应按规定时间定期移种。一般每移种3次后作一次全面鉴定。注意菌种有无污染和变异,如发现污染和变异时,应及时更换。 

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